Geeni kloonimise ja PCR erinevused

Peamine erinevus - geeni kloonimine vs PCR
 

Mitme DNA koopia sünteesi konkreetsest DNA fragmendist nimetatakse DNA amplifikatsiooniks. On kaks peamist DNA amplifitseerimise protsessi, nimelt geenide kloonimine ja PCR. Peamine erinevus geenide kloonimise ja PCR vahel on, geeni kloonimine annab konkreetse geeni mitu koopiat in vivo konstrueerides rekombinantse DNA ja kasvatades peremeesbakteris, samal ajal kui PCR toodab spetsiifilise DNA fragmendi miljoneid koopiaid in vitro korduvad denatureerimise ja sünteesi tsüklid.

SISU
1. Ülevaade ja peamised erinevused
2. Mis on geenikloneerimine
3. Mis on PCR
4. Kõrvuti võrdlus - geeni kloonimine vs PCR
5. Kokkuvõte

Mis on geenikloneerimine?

Geenide kloonimine on tehnika, mida kasutatakse konkreetse geeni leidmiseks ja paljundamiseks organismi ekstraheeritud genoomsest DNA-st rekombinantse DNA ehitamise teel. Genoomne DNA sisaldab tuhandeid erinevaid valke kodeerivaid geene. DNA ekstraheerimisel sisaldab see kõiki võimalikke geene, mida see kanda saab. Geenide kloonimistehnika on võimaldanud tuvastada spetsiifilise geeni kogu DNA-st. Seetõttu on geenide kloonimine oluline vahend molekulaarbioloogias.

Organismi genoomse raamatukogu moodustamine on geenide kloonimisel hädavajalik, kui vastava geeni asukohast DNA-s pole aimugi. Genoomikogu luuakse järgmiste sammude abil.

Samm 1: Kogu DNA ekstraheerimine organismist, mis sisaldab soovitud geeni.

2. samm: Ekstraheeritud DNA piiratud seedimine väikeste juhitavate fragmentide saamiseks. Seda etappi hõlbustavad restriktsiooni endonukleaasid.

3. samm: Sobiva vektori valimine ja vektori DNA avamine, kasutades samu restriktsiooni endonukleaase. Bakteriaalseid plasmiide ​​kasutatakse tavaliselt võõra DNA kandmiseks vektoritena. Plasmiidid on väikesed DNA ringid, mis asuvad bakterites.

4. samm: Vektori DNA ja fragmenteeritud DNA kombineerimine rekombinantse DNA molekuli saamiseks. Seda etappi reguleerib DNA ligaas.

5. samm: Rekombinantsete DNA molekulide ülekandmine peremeesbakteritesse. Seda etappi nimetatakse ümberkujundamiseks ja seda tehakse kuumašoki abil.

5. samm: Transformeeritud bakterirakkude sõelumine söötmel. Transformatsiooni lõpus saadakse transformeeritud ja mittetransformeerunud peremeesrakkude segapopulatsioon. Kuna huvipakkuv geen hõlmab ainult transformeeritud peremeesrakke. Seega on vaja valida transformeeritud rakud. Valik tehakse selektiivsöötme abil, mis sisaldab antibiootikume. Ainult transformeeritud rakud kasvavad sellel skriinimissöötmel, mis võimaldab selektsiooni.

6. samm: Bakterite kasvatamine geenikogu loomiseks. Selles etapis viiakse transformeeritud peremeesrakud värskesse söötmesse, mis tagab optimaalse kasvunõude. Kultuuriplaatidel olevad kolooniad kokku tähistavad selle organismi genoomi raamatukogu.

7. samm: Huvipakkuvat geeni sisaldav rekombinantne DNA molekul tuleb skriinida tuhandetest rekombinantse DNA kloonitud fragmentidest. Seda saab saavutada sondide abil, mis tähistavad spetsiifilist geeni või selle geeni tulemusel saadud spetsiifiline valk.

Kui bakteriaalset kolooniat sisaldav huvitatud geen on kogu kolooniate põhjal tuvastatud, on võimalik teha geeni sisaldava rekombinantse plasmiidi miljonid koopiad.

Geenide kloonimist kasutatakse geenikogude loomiseks, spetsiaalsete valkude, vitamiinide, antibiootikumide, hormoonide tootmiseks, organismide genoomide järjestamiseks ja kaardistamiseks, üksikute DNA koopiate tegemiseks kriminalistikas jms..

Joonis_1: geeni kloonimine

Mis on PCR?

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on meetod, mis genereerib suure hulga konkreetse DNA fragmendi koopiaid. Spetsiifilise DNA järjestuse eksponentsiaalne amplifikatsioon saavutatakse PCR-ga all in vitro tingimusi. See tehnika on molekulaarbioloogias väga võimas tööriist, kuna selle abil saab väikese DNA proovi korrutada kasutatavaks koguseks. Kary Mullis tutvustas PCR-i 1983. aastal ja see auhinnatud leiutis lõi tohutu edasimineku molekulaarbioloogias.

PCR-meetod järgib korduvaid PCR-reaktsioone, nagu on näidatud joonisel 02. Üks PCR-reaktsioon koosneb kolmest põhietapist, mis toimuvad kolmel erineval temperatuuril; kahe ahelaga denatureerimine temperatuuril 94 ° C ⁰C, praimerite lõõmutamine temperatuuril 68 ° C ⁰C ja ahela pikenemine 72 ° C juures ⁰C. Seetõttu tuleks PCR-i läbiviimisel temperatuuri kõikumist korraliku replikatsiooni jaoks kõrgel hoida. PCR viiakse läbi PCR-masinas PCR-torude sees. PCR-torud laaditakse õigete PCR-segudega, mis sisaldavad matriitsi DNA-d, Taq-polümeraasi, praimereid, dNTP-sid ja puhvrit. Kaheahelalise proovi DNA denatureerimine üheahelaliseks DNAks purustatakse vesiniksidemed komplementaarsete aluste vahel temperatuuril 94 - 98 ⁰C. Seejärel eksponeeritakse praimerite jaoks matriits-DNA üksikud ahelad. Tuleks varustada paar praimerit (edasi ja tagasi) ning need peaksid olema kõrge temperatuuri talumiseks termostabiilsed. Praimerid on üheahelalised lühikesed DNA järjestused, mis täiendavad siht-DNA fragmendi otsi. PCR-is kasutatakse sünteetilisi praimereid. Praimerid seostuvad proovi DNA komplementaarsete alustega ja algatavad uue ahela sünteesi. Seda etappi katalüüsib ensüüm nimega Taq polümeraas; termostabiilne DNA polümeraasi ensüüm, mis on eraldatud Thermus auqaticus. Kui praimerid ja nukleotiidid (ehitusplokid) on saadaval, konstrueerib Taq polümeraas uue DNA ahela, mis on komplementaarne matriitsi DNA-ga. PCR-programmi lõpus täheldatakse amplifitseeritud DNA fragmenti, kasutades geelelektroforeesi. Kui on vaja täiendavat analüüsi, puhastatakse PCR-produkt geelist.

PCR on väga kasulik geneetiliste ja omandatud haiguste diagnoosimiseks ja jälgimiseks, kurjategijate tuvastamiseks (kohtuekspertiisi valdkonnas), DNA sihtrühma struktuuri ja funktsioonide uurimiseks, organismide genoomide järjestamiseks ja kaardistamiseks jne. PCR on muutunud rutiinne laboritehnika meditsiini- ja molekulaarbioloogia uurimislaborites teadlaste seas, kuna sellel on lai valik rakendusi.

Joonis_2: polümeraasi ahelreaktsioon

Mis vahe on geenkloonimisel ja PCR-il?

Geeni kloonimine vs PCR
Geenide kloonimine on protsess, mis teeb konkreetsest geenist mitu koopiat in vivo rekombinantse DNA kaudu ja muundades peremeesbakteriks.	PCR-meetodil saadakse konkreetse DNA järjestuse mitu koopiat in vitro läbi korduvate PCR reaktsioonide tsüklite.
Rekombinantse DNA konstrueerimise nõue
Geeni lokaliseerimiseks toodetakse rekombinantne DNA.	Rekombinantset DNA-d ei toodeta.
Vajadus tööjõu järele
See protsess on töömahukas.	Intensiivset tööjõudu pole vaja.
In vivo või in vitro protsess
Rekombinantse DNA konstrueerimine on in vitro ja DNA amplifikatsioon on in vivo.	DNA võimendamine toimub täielikult in vitro.

Kokkuvõte - geenkloonimine vs PCR

Geeni kloonimine ja PCR on kaks meetodit, mida kasutatakse DNA amplifitseerimiseks. PCR on in vitro protsess, mis teeb konkreetse DNA fragmendi DNA mitu koopiat ilma rekombinantset DNA ja peremeesorganismi kasutamata. Geenide kloonimine on peamiselt in vivo protsess, mille tulemuseks on rekombinantse DNA konstrueerimise teel peremeesorganismis huvitatud geeni mitu koopiat. See on erinevus geeni kloonimise ja PCR vahel.

Viide:
1. Griffiths, Anthony JF. "Konkreetse geeni kloonimine." Kaasaegne geneetiline analüüs. USA Riiklik Meditsiiniraamatukogu, 1. jaanuar 1999. Veeb. 22. veebruar 2017
2. ”Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR).” Riiklik biotehnoloogiaalane teabekeskus. USA Riiklik Meditsiiniraamatukogu, n.d. Võrk. 22. veebruar 2017

Pilt viisakalt:
1. “Joonis 17 01 06” CNX OpenStax - (CC BY 4.0) kaudu Commons Wikimedia
2. Madrime'i “PCR” - oma töö (CC BY-SA 3.0) Commons Wikimedia kaudu