Erinevus NGS-i ja Sangeri järjestuse vahel

Peamine erinevus - NGS vs Sanger Sekveneerimine
 

Next Generation Sequencing (NGS) ja Sanger Sequencing on kahte tüüpi nukleotiidide järjestamise tehnikad, mis on aja jooksul välja töötatud. Sangeri järjestusmeetodit kasutati laialdaselt aastaid ja NGS asendas selle eeliste tõttu hiljuti. Peamine erinevus NGS-i ja Sanger Sequencingi vahel on see NGS töötab põhimõttel sekveneerida miljonid järjestused samaaegselt kiiresti järjestussüsteemi kaudu, samal ajal kui Sangeri sekveneerimine toimib ahela lõpetamise põhimõttel, kuna DNA replikatsiooni ajal on DNA polümeraasi ensüümi abil selektiivselt sisse viidud dideoksünukleotiidid ja tulemuseks on fragmentide eraldamine kapillaaride kaupa elektroforees.

SISU
1. Ülevaade ja peamised erinevused
2. Mis on nukleotiidide järjestamine
3. Mis on NGS?
4. Mis on Sangeri sekveneerimine
5. Kõrvuti võrdlus - NGS vs Sanger Järjestus
6. Kokkuvõte

Mis on nukleotiidide järjestamine?

Geneetiline teave salvestatakse organismi DNA või RNA nukleotiidijärjestustesse. Nukleotiidide õige järjestuse määramise protsessi (kasutades nelja alust) antud fragmendis (geenis, geenide klastris, kromosoomis ja terviklikus genoomis) nimetatakse nukleotiidide järjestamiseks. Geenide struktuuri ja funktsioonide analüüsimisel on väga oluline genoomi uuringutes, kohtuekspertiisi uuringutes, viroloogias, bioloogilises süsteemis, meditsiinilises diagnoosimises, biotehnoloogias ja paljudes teistes valdkondades. Teadlaste väljatöötatud järjestamismeetodeid on erinevat tüüpi. Nende hulgas, Sangeri sekveneerimine Frederick Sangeri poolt 1977. aastal välja töötatud tooted olid laialt levinud ja populariseeritud pikka aega kuni Järgmise põlvkonna järjestus asendas selle.

Mis on NGS?

Järgmise põlvkonna järjestus (NGS) on termin, mida kasutatakse tänapäevastele suure jõudlusega järjestusprotsessidele viitamiseks. See kirjeldab mitmeid erinevaid tänapäevaseid järjestustehnoloogiaid, mis pöörasid pöörde genoomiuuringutele ja molekulaarbioloogiale. Nendeks meetoditeks on Illumina sekveneerimine, Roche 454 sekveneerimine, ioonide prootonite sekveneerimine ja SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection) sekveneerimine. NGS-süsteemid on kiiremad ja odavamad. NGS-süsteemides kasutatakse nelja peamist DNA järjestamise meetodit: pürosekveneerimine, järjestamine sünteesi teel, järjestamine ligeerimise teel ja ioonpooljuhtide järjestamine. Paralleelselt saab sekveneerida suurt hulka DNA või RNA ahelaid (miljoneid). See võimaldab kogu organismide genoomi sekveneerida lühikese aja jooksul, erinevalt Sangeri sekveneerimisest, mis võtab rohkem aega.

NGS-il on Sangeri tavapärase sekveneerimise meetodi ees palju eeliseid. See on kiire, täpsem ja kulutõhusam protsess, mida saab läbi viia väikese valimi suurusega. NGS-i saab kasutada metagenoomilistes uuringutes, sisestustest ja deletsioonidest jne tulenevate variatsioonide tuvastamiseks individuaalses genoomis ja geeniekspressioonide analüüsimisel..

Joonis_1: NGS-i järjestamise areng

Mis on Sangeri sekveneerimine?

Sangeri sekveneerimine on Frederick Sangeri ja tema kolleegide poolt 1977. aastal välja töötatud sekveneerimismeetod, et määrata kindlaks antud DNA fragmendi täpne nukleotiidide järjestus. Seda tuntakse ka kui ahela terminatsiooni järjestamine või Dideoksüjärjestus. Selle meetodi tööpõhimõte on ahelate sünteesi lõpetamine DNA polümeraasi abil DNA polümeraasi abil selektiivse inkorporeerimise teel ahelasse, mis lõpetab dideoksünukleotiidid (ddNTP-d) nagu ddGTP, ddCTP, ddATP ja ddTTP. Normaalsetel nukleotiididel on 3 'OH rühmad fosfodiestersideme moodustamiseks külgnevate nukleotiidide vahel, et jätkata ahela moodustumist. Kuid ddNTP-del puudub see 3 'OH-rühm ja nad ei suuda moodustada nukleotiidide vahel fosfodiestersidemeid. Seega on keti pikenemine lakitud.

Selle meetodi korral toimib sekveneeritav üheahelaline DNA matriitsidena in vitro DNA süntees. Muud nõuded on oligonukleotiidpraimer, deoksünukleotiidide prekursorid ja DNA polümeraasi ensüüm. Kui sihtmärgifragmendi külgnevad otsad on teada, saab praimereid DNA replikatsiooniks hõlpsasti kujundada. Neljas eraldi katseklaasis viiakse läbi neli eraldi DNA sünteesi reaktsiooni. Igal torul on koos teiste nõuetega eraldi ddNTP-d. Konkreetsest nukleotiidist lisatakse dNTP-de ja ddNTP-de segu. Samamoodi viiakse läbi neli eraldi reaktsiooni neljas katsutis nelja seguga. Pärast reaktsioone tuvastatakse DNA fragmendid ja muundatakse fragmendi muster järjestuse informatsiooniks. Saadud DNA fragmendid denatureeritakse termiliselt ja eraldatakse geelelektroforeesiga. Radioaktiivsete nukleotiidide kasutamisel saab polüakrüülamiidi geeli riba mustrit visualiseerida autoradiograafia abil. Kui selles meetodis kasutatakse fluorestsentsmärgistatud dideoksünukleotiide, saab seda leevendada geeli lugemisel ja lasta läbi laserkiire, et fluorestsentsdetektor tuvastaks. Selleks, et vältida vigu, mis võivad tekkida, kui jada loetakse silmaga ja sisestatakse käsitsi arvutisse, arenes see meetod automaatsete järjestajate kasutamiseks koos arvutiga.

Seda meetodit kasutatakse DNA järjestamiseks inimese genoomi projektist. Seda meetodit kasutatakse täiustatud modifikatsioonidega endiselt, kuna see annab täpset järjestusteavet, vaatamata sellele, et see on kallis ja aeglane protsess.

Joonis_2: Sangeri sekveneerimine

Mille poolest NGS ja Sanger Sequencing erinevad??

NGS vs Sanger Järjestus
Järgmise põlvkonna järjestus (NGS) viitab kaasaegsetele suure jõudlusega järjestusprotsessidele. See kirjeldab mitmeid erinevaid kaasaegseid järjestamistehnoloogiaid	Sangeri sekveneerimine on Frederick Sangeri väljatöötatud järjestamismeetod, et määrata kindlaks antud DNA fragmendi täpne nukleotiidide järjekord.
Kulutõhususe
NGS on odavam protsess, kuna see vähendab aega, inimjõudu ja kemikaale.	See on kulukas protsess, kuna see võtab aega, inimese jõud ja rohkem kemikaale.
Kiirus
See on kiirem, kuna nii keemiline kui ka paljude kiudude tuvastamine toimub paralleelselt.	See on aeganõudev, kuna keemiline tuvastamine ja signaali tuvastamine toimub kahe eraldi protsessina ja korraga saab lugeda ainult ahelat.
Töökindlus
NGS on usaldusväärne.	Sangeri sekveneerimine on vähem usaldusväärne
Näidissuurus
NGS nõuab vähem DNA kogust.	See meetod vajab suures koguses matriitsi DNA-d.
DNA alused sekveneeritud fragmendi kohta
DNA aluste arv sekveneeritud fragmendi kohta on väiksem kui Sangeri meetodil	Genereerivad järjestused on NGS-järjestustest pikemad.

Kokkuvõte - NGS vs Sanger Sequencing

NGS ja Sanger Sequencing on nukleotiidide järjestamise tehnikad, mida kasutatakse laialdaselt molekulaarbioloogias. Sangeri sekveneerimine on varajane sekveneerimise meetod, mille asendas NGS. Peamine erinevus NGS-i ja Sangeri sekveneerimise vahel on see, et NGS on kiire, täpsem ja kulutõhusam protsess kui Sangeri sekveneerimine. Mõlemad meetodid tekitasid suuri geneetika ja biotehnoloogia puhanguid.

Viide:
1. Nowrousian, Minou. "Eukarüootsete mikroorganismide järgmise põlvkonna järjestamise tehnikad: bioloogiliste probleemide järjestamisel põhinevad lahendused." Eukarüootne rakk. Ameerika Mikrobioloogia Selts, september 2010. Veeb. 18. veebruar 2017
2. Sanger, F., S. Nicklen ja A. R. Coulson. "DNA järjestamine ahelaga lõppevate inhibiitoritega." Riikliku Teaduste Akadeemia toimetised 74.12 (1977): 5463-467. võrk.
3. Liu, Lin, Yinhu Li, Siliang Li, Ni Hu, Yimin He, Ray Pong, Danni Lin, Lihua Lu ja Maggie Law. "Järgmise põlvkonna järjestussüsteemide võrdlus." Ajakiri Biomedicine and Biotechnology 2012 (2012): 1.-11. võrk.

Pilt viisakalt:
“Sangeri sekveneerimine” autor Estevezj - Oma töö (CC BY-SA 3.0) Commonsi Wikimedia kaudu 
“Arengud uue põlvkonna järjestuses” Nederbragt, Lex (2012) - (CC BY 3.0) Commonsi Wikimedia kaudu