Erinevus põhjapoolse lõuna ja lääne blottide vahel

Peamine erinevus - põhjapoolne vs lõunapoolne vs läänepoolne blottimine
 

DNA, RNA ja valkude spetsiifiliste järjestuste tuvastamine on molekulaarbioloogia eri tüüpi uuringute jaoks hädavajalik. Geelelektroforees on meetod, mis eraldab DNA, RNA ja valgud vastavalt nende suurusele. Geeliprofiilide põhjal tuvastatakse konkreetne DNA järjestus, RNA järjestus või valk spetsiaalsete meetoditega, mida nimetatakse blotimiseks ja hübridiseerimiseks märgistatud proovidega. Blotimismeetodeid on kolme tüüpi, nimelt lõuna-, põhja- ja lääneosa. Põhiline erinevus lõunapoolse ja läänepoolse blotimise vahel on molekuli tüübil, mille see proovist tuvastab. Southern blot on meetod, mis tuvastab DNA proovist spetsiifilise DNA järjestuse. Northern blot on meetod, mis tuvastab RNA proovist spetsiifilise RNA järjestuse. Western blot on meetod, mis tuvastab valguproovist spetsiifilise valgu.

SISU
1. Ülevaade ja peamised erinevused
2. Mis on Lõuna-blottimine
3. Mis on Northern blotting
4. Mis on Western blotting
5. Kõrvuti võrdlus - põhja vs lõuna vs lääne blot
6. Kokkuvõte

Mis on Lõuna-blottimine?

Lõunapoolse blotimise tehnika töötas välja E. M. Southern 1975. aastal spetsiifilise DNA järjestuse tuvastamiseks DNA proovist. See on esimene molekulaarbioloogias kasutusele võetud blotimise tehnika. See võimaldas tuvastada spetsiifilisi geene DNA-st, spetsiifilisi fragmente DNA-st jne. Lõuna-blotimismeetodil on mitu etappi. Need on järgmised.

1. Proovist eraldati DNA ja digereeriti restriktsiooni endonukleaasidega.
2. Lagundatud proov eraldatakse agaroosi geelelektroforeesiga.
3. Geelis olevad DNA fragmendid denatureeritakse leeliselise lahuse abil üksikuteks ahelateks.
4. Üheahelaline DNA kantakse kapillaariülekande teel nitrotselluloosi filtrimembraanile.
5. Ülekantud DNA kinnitatakse membraanile püsivalt.
6. Membraanil olev fikseeritud DNA hübridiseeritakse märgistatud sondidega.
7. Seondumata DNA pestakse membraanilt pesemisega.
8. Röntgendifilm eksponeeritakse membraanile ja valmistatakse autoradiograaf.

Lõuna-blotti kasutatakse molekulaarbioloogia erinevates aspektides. See on kasulik RFLP kaardistamisel, kohtuekspertiisi uuringutel, DNA metüleerimisel geeniekspressioonil, muteerunud geenide tuvastamisel geneetiliste häirete korral, DNA sõrmejälgede võtmisel jne..

Joonis 01: Lõuna-blotimise tehnika

Mis on Northern blotting?

Northern blot on meetod, mis on kavandatud spetsiifilise RNA või mRNA järjestuse tuvastamiseks proovist geeni ekspressiooni uurimiseks. Selle tehnika töötasid välja Alwine, Kemp ja Stark 1979. aastal. See erineb täiendavatest ja Western blot meetoditest mitme etapi tõttu. Kuid seda tehnikat teostatakse ka geelelektroforeesi, blotimise ja hübridiseerimise teel spetsiifiliste märgistatud proovidega ja detekteerimisega. Northern blot meetodit teostatakse järgmiselt.

1. Proovist ekstraheeritakse RNA ja eraldatakse geelelektroforeesiga.
2. RNA kantakse geelist blotmembraanile ja fikseeritakse.
3. Membraani töödeldakse cDNA-st või RNA-st valmistatud märgistatud sondiga (sond täiendab proovis olevat konkreetset järjestust).
4. Sond inkubeeritakse membraaniga, et seostuda kindla järjestusega.
5. Seondumata sondid pestakse maha.
6. Hübridiseeritud fragmendid tuvastatakse autoradiograafiga.

Northern blot on oluline vahend hübridiseeritud mRNA tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks, RNA lagunemise uurimiseks, RNA poolestusaja hindamiseks, RNA splaissimise tuvastamiseks, geeniekspressiooni uurimiseks jne..

Joonis 02: Põhja blot

Mis on Western blotting?

Western blot on meetod spetsiifilise valgu tuvastamiseks valgu segust märgistatud antikeha kasutamisega. Seetõttu on Western blot tuntud ka kui immunoblot. Seda tehnikat tutvustas Towbin et al aastal 1979 ja nüüd tehakse seda laborites valguanalüüsi jaoks tavapäraselt. Sammud on järgmised.

1. Valgud ekstraheeritakse proovist
2. Valgud eraldatakse suuruse järgi polüakrüülamiidi geelelektroforeesi abil
3. Eraldatud molekulid kantakse elektroporatsiooni abil PVDF-membraani või nitrotselluloosmembraani
4. Membraan blokeeritakse antikehadega mittespetsiifilise sidumise jaoks
5. Ülekantud valgud on seotud primaarse antikehaga (ensüümiga märgistatud antikehad).
6. Membraan pestakse mittespetsiifiliselt seotud primaarsete antikehade eemaldamiseks
7. Seotud antikehad tuvastatakse substraadi lisamisega ja moodustunud värvilise sademe tuvastamisega

Western blot-analüüs on kasulik HIV-vastaste antikehade tuvastamiseks inimese seerumiproovis. Western blot'i saab kasutada ka B-hepatiidi nakkuse kinnitava testi ja hullulehma tõve lõpliku testina.

Joonis 03: Western blot

Mis vahe on põhjapoolse lõuna ja lääne blottide vahel?

Põhja vs Lõuna vs Lääne blottimine
Avastatud molekuli tüüp
Põhja blottimine	Northern blot tuvastab RNA proovist spetsiifilise RNA järjestuse.
Lõuna-blottimine	Southern blot tuvastab DNA proovis spetsiifilise DNA järjestuse.
Western blotting	Western blot tuvastab valguproovist spetsiifilise valgu.
Geeli tüüp
Põhja blottimine	Selleks kasutatakse agaroosi / formaldehüüdi geeli.
Lõuna-blottimine	Selleks kasutatakse agaroosi geeli.
Western blotting	Selleks kasutatakse polüakrüülamiidi geeli.
Blotimismeetod
Põhja blottimine	See on kapillaarülekanne.
Lõuna-blottimine	See on kapillaarülekanne.
Western blotting	See on elektriline ülekanne.
Kasutatud sondid
Põhja blottimine	cDNA või RNA sondid, mis on märgistatud radioaktiivselt või mitteradioaktiivselt.
Lõuna-blottimine	DNA sondid on märgistatud radioaktiivselt või mitteradioaktiivselt.
Western blotting	Sondidena kasutatakse primaarseid antikehi.
Tuvastussüsteem
Põhja blottimine	Selleks kasutatakse autoradiograafi või valguse või värvimuutuse tuvastamist.
Lõuna-blottimine	Selleks kasutatakse autoradiograafi, valguse või värvimuutuse tuvastamist.
Western blotting	Selleks kasutatakse valguse või värvimuutuse tuvastamist.

Kokkuvõte - põhja vs lõuna vs lääne blot

Blotimine on spetsiaalne tehnika, mis on välja töötatud proovidest konkreetse DNA, RNA või valgu tuvastamiseks. Spetsiifilise molekuli tüübi tuvastamiseks on kolm eraldi blotimisprotseduuri: põhja-, lõuna- ja lääneosa. Northern blot meetod on loodud spetsiifilise RNA järjestuse tuvastamiseks RNA segust. Southern blot meetod võimaldab tuvastada DNA proovist spetsiifilist DNA järjestust ja spetsiifilise valgu tuvastamiseks valgu segust on välja töötatud Western blot meetod..

Viited
1. Gibbons, Janay. “Western blot: ülevaade valguülekandest.” Põhja-Ameerika meditsiiniteaduste ajakiri. Medknow Publications & Media Pvt Ltd, märts 2014. Veeb. 27. märts 2017
2. Brown, T. “Lõuna-blottimine.” Immunoloogia praegused protokollid. USA Riiklik Meditsiiniraamatukogu, mai 2001. Veeb. 27. märts 2017
3. Tema, Shan L. “Northern blot”. Ensüümoloogia meetodid. USA Riiklik Meditsiiniraamatukogu, 2013. Veeb. 27. märts 2017

Pilt viisakalt:
1. „Northern Blot Scheme” autor RNA405 - Omad tööd (üldkasutatav) Commonsi Wikimedia kaudu
2. “Western blot 114A” autor Amanthabagdon - Omad tööd (avalik omand) Commons Wikimedia kaudu