Erinevus Sangeri sekveneerimise ja pürosekveneerimise vahel

Peamine erinevus - Sangeri sekveneerimine vs pürosekveneerimine
 

DNA järjestamine on DNA analüüsi jaoks väga oluline, kuna teadmised konkreetse DNA piirkonna nukleotiidide õige paigutuse kohta näitavad selle kohta palju olulist teavet. DNA järjestamise meetodeid on erinevaid. Sangeri sekveneerimine ja pürosekveneerimine on kaks erinevat DNA järjestuse määramise meetodit, mida kasutatakse laialdaselt molekulaarbioloogias. Peamine erinevus Sangeri järjestamise ja pürosekveneerimise vahel on see Sangeri järjestamisel kasutatakse DNA sünteesi lõpetamiseks nukleotiidijärjestuse lugemiseks dideoksünukleotiide, pürosekveneerimisega tuvastatakse pürofosfaadi vabanemine, lisades nukleotiidid ja sünteesides komplementaarse järjestuse, et lugeda järjestuse täpset järjestust.

SISU
1. Ülevaade ja peamised erinevused
2. Mis on Sangeri sekveneerimine
3. Mis on pürosekvents
4. Kõrvuti võrdlus - Sangeri järjestamine vs pürosekveneerimine
5. Kokkuvõte

Mis on Sangeri sekveneerimine?

Sangeri sekveneerimine on esimese põlvkonna DNA sekveneerimise meetod, mille töötasid välja Frederick Sanger ja tema kolledžid 1977. aastal. Seda tuntakse ka kui Keti lõpetamise järjestamine või Dideoksüjärjestus kuna see põhineb ahela terminatsioonil dideoksünukleotiidide (ddNTP) poolt. Seda meetodit kasutati laialdaselt rohkem kui 30 aastat kuni uue põlvkonna järjestuse (NGS) väljatöötamiseni. Sangeri sekveneerimise tehnika võimaldas leida õige nukleotiidijärjestuse või siduda konkreetse DNA fragmendi. See põhineb ddNTP-de valikulisel inkorporeerimisel ja DNA sünteesi lõpetamisel in vitro DNA replikatsioon. 3 'OH-rühmade puudumine fosfodiestersidemete moodustumise jätkamiseks külgnevate nukleotiidide vahel on ddNTP-de ainulaadne omadus. Seega, kui ddNTP on kinnitatud, lakkab ahela pikenemine ja lõpeb sellest hetkest. Sangeri sekveneerimisel on neli ddNTP-d - ddATP, ddCTP, ddGTP ja ddTTP. Need nukleotiidid peatavad DNA replikatsiooniprotsessi, kui nad on lülitatud DNA kasvavasse ahelasse ja tulemuseks on erineva pikkusega lühike DNA. Nende lühikeste DNA ahelate järjestamiseks geelil kapillaargeeli elektroforeesi abil, nagu on näidatud joonisel 01.

Joonis 1: sünteesitud lühikese DNA kapillaargeelelektroforees

Sest in vitro DNA replikatsioon, tuleks esitada vähe nõudeid. Need on DNA polümeraasi ensüümid, matriits-DNA, oligonukleotiidpraimerid ja deoksünukleotiidid (dNTP-d). Sangeri sekveneerimisel viiakse DNA replikatsioon läbi neljas eraldi katseklaasis koos nelja tüüpi ddNTP-dega. Deoksünukleotiidid ei ole täielikult asendatud vastavate ddNTP-dega. Torusse lisatakse konkreetse dNTP segu (näiteks; dATP + ddATP) ja seda korratakse. Neli eraldi tuubi toodet töödeldakse geelil neljas eraldi süvendis. Seejärel saab geeli lugedes selle järjestuse konstrueerida, nagu on näidatud joonisel 02.

Joonis 02: Sangeri järjestamine

Sangeri järjestamine on oluline tehnika, mis aitab paljudes molekulaarbioloogia valdkondades. Inimese genoomi projekt viidi Sangeri järjestuspõhiste meetodite abil edukalt lõpule. Sangeri järjestamine on kasulik ka sihtmärk-DNA järjestamisel, vähi ja geneetiliste haiguste uurimisel, geeniekspressiooni analüüsil, inimese tuvastamisel, patogeeni tuvastamisel, mikroobide järjestamisel jne..

Sangeri järjestamisel on mitmeid puudusi:

• Sekveneeritava DNA pikkus ei tohi olla pikem kui 1000 aluspaari
• Korraga saab sekveneerida ainult ühe ahela.
• Protsess on aeganõudev ja kallis.

Seetõttu töötati nende probleemide ületamiseks aja jooksul välja uued täiustatud järjestamise tehnikad. Kuid Sangeri sekveneerimine on endiselt ülitäpse tulemuse tõttu kuni umbes 850 aluspaari pikkuste fragmentide kasutamine.

Mis on pürosekvents?

Pürosekveneerimine on uudne DNA sekveneerimise tehnika, mis põhineb „sünteesi järgi järjestamisel”. See tehnika põhineb pürofosfaadi vabanemise tuvastamisel nukleotiidi liitumisel. Protsessis kasutatakse nelja erinevat ensüümi: DNA polümeer, ATP sulfurülaas, lutsiferaas ja apüraas ning kaks substraati - adenosiini 5 'fosfosulfaat (APS) ja lutsiferiin.

Protsess algab praimeri seondumisega üheahelalise DNA matriitsiga ja DNA polümeraas alustab sellele komplementaarsete nukleotiidide liitmist. Kui nukleotiidid ühinevad (nukleiinhappe polümerisatsioon), vabastab see pürofosfaadi (kaks omavahel seotud fosfaatrühma) rühmad ja energia. Iga nukleotiidi lisamine vabastab ekvimolaarse koguse pürofosfaati. Pürofosfaat muundub ATP substraadi juuresolekul ATP sulfurülaasi abil ATP-ks. Loodud ATP juhib lutsiferiini vahendatud lutsiferiini muundamist oksüluutsiferiiniks, tekitades nähtavat valgust kogustes, mis on proportsionaalsed ATP-de kogusega. Valgus tuvastatakse footonituvastusseadme või fotomultiplikaatori abil ja see loob pürogrammi. Apüraas lagundab ATP-d ja mitteseotud dNTP-sid reaktsioonisegus. dNTP lisamine toimub üks kord korraga. Kuna nukleotiidi lisamine on teada vastavalt valguse sisseviimisele ja tuvastamisele, saab määrata matriitsi järjestuse. Proovi DNA nukleotiidijärjestuse genereerimiseks kasutatakse pürogrammi, nagu on näidatud joonisel 03.

Pürosekveneerimine on üksikute nukleotiidide polümorfismi analüüsimisel ja lühikeste DNA lõikude järjestamisel väga oluline. Suur täpsus, paindlikkus, automatiseerimise lihtsus ja paralleelne töötlemine on pürosekveneerimise eelised Sangeri sekveneerimise tehnikate ees.

Joonis 03: pürosekveneerimine

Mis vahe on Sangeri sekveneerimise ja pürosekveneerimise vahel?

Sangeri järjestamine vs pürosekveneerimine
Sangeri sekveneerimine on DNA sekveneerimise meetod, mis põhineb ddNTP-de valikulisel inkorporeerimisel DNA polümeraasi abil ja ahela terminatsioonil.	Pürosekveneerimine on DNA järjestuse määramise meetod, mis põhineb pürofosfaadi vabanemise tuvastamisel nukleotiidi lisamisel.
DdNTP kasutamine
ddNTP-sid kasutatakse DNA replikatsiooni lõpetamiseks	ddNTP-sid ei kasutata.
Ensüümid kaasatud
Kasutatakse DNA polümeraasi.	Kasutatakse nelja ensüümi: DNA polümeraas, ATP sulfurülaas, lutsiferaas ja apüraas.
Kasutatud aluspinnad
APS-i ja Luciferiini ei kasutata.	Kasutatakse adenosiin-5 'fosfosulfaati (APS) ja lutsiferiini.
Maksimaalne temperatuur
See on aeglane protsess.	See on kiire protsess.

Kokkuvõte - Sangeri sekveneerimine vs pürosekveneerimine

Sangeri sekveneerimine ja pürosekveneerimine on kaks DNA järjestusmeetodit, mida kasutatakse molekulaarbioloogias. Sangeri järjestamine konstrueerib nukleotiidide järjestuse järjestuses, lõpetades ahela pikenemise, samas kui pürosekveneerimine konstrueerib nukleotiidide täpse järjestuse järjestuses, lisades nukleotiidid ja detekteerides pürofosfaatide vabanemise. Seetõttu on Sangeri sekveneerimise ja pürosekveneerimise peamine erinevus selles, et Sangeri sekveneerimine toimib sekveneerimise teel ahela terminatsiooni teel, samal ajal kui pürosekveneerimine töötab sekveneerimisega sünteesi teel.

Viide:
1. Fakruddin, Md ja Abhijit Chowdhury. "Pürosekveneerimine - alternatiiv traditsioonilisele Sangeri sekveneerimisele." Ameerika ajakiri biokeemiast ja biotehnoloogiast. Teaduspublikatsioonid, 2. märts 2012. Veeb. 28. veebruar 2017.
2. “Sangeri järjestamine”. Sangeri sekveneerimine - ScienceDirect teemad. N.p., n.d. Võrk. 28. veebruar 2017

Pilt viisakalt:
1. Chrideph Goemans (modifiziert) “Didesoxy-Methode” - dr Norman Mauder, auf Basin einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) Commons Wikimedia kaudu
2. „Sanger-DNA-seq” - Enzo poolakeelse Vikipeedia (CC BY-SA 3.0) kaudu Commons Wikimedia
3. Pürosequencing mikrobioloogiliste baitide kaupa (CC BY-SA 2.0) Flickri kaudu