Erinevus PCR ja DNA järjestamise vahel

Peamine erinevus - PCR vs DNA järjestamine
 

PCR ja DNA järjestamine on molekulaarbioloogia kaks olulist tehnikat. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on protsess, mille käigus luuakse DNA fragmendist suur arv koopiaid. DNA järjestamine on tehnika, mille tulemuseks on antud DNA fragmendi nukleotiidide täpne järjekord. See on peamine erinevus PCR ja DNA sekveneerimise vahel. PCR on üks peamisi DNA sekveneerimise etappe.

SISU
1. Ülevaade ja peamised erinevused
2. Mis on PCR
3. Mis on DNA järjestamine
4. Kõrvuti võrdlus - PCR vs DNA sekveneerimine
5. Kokkuvõte

Mis on PCR?

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on DNA amplifitseerimise tehnika, mida kasutatakse molekulaarbioloogias. See toodab konkreetse DNA fragmendi tuhandeid kuni miljoneid koopiaid. Selle meetodi töötas välja Kary Mullis 1983. Selle tehnika kohaselt toimib amplifitseeritav DNA fragment matriitsina ja DNA polümeraasi ensüüm lisab praimerile komplementaarseid nukleotiide, mis on saadaval PCR segus. PCR-reaktsiooni lõpus sünteesitakse palju proovi DNA koopiaid.

PCR segul on erinevad komponendid, sealhulgas DNA, DNA polümeraas (Taq polümeraas), praimerid (edasi ja tagasi praimerid), nukleotiidid (DNA ehitusplokid) ja puhver. PCR juhtub PCR-masinas ja õige PCR-segu tuleks masinasse laadida ning õiget programmi juhtida. See meetod võimaldab väga väikeses koguses DNA-st toota tuhandetest miljonitesse DNA teatud sektsiooni koopiaid.

PCR reaktsioonid toimuvad tsüklilisel viisil, et saada geelil nähtav kogus PCR tooteid. PCR-reaktsioonis on kolm peamist etappi, nimelt denatureerimine, praimeri lõõmutamine ja ahela pikendamine, nagu on näidatud joonisel 01. Need kolm etappi toimuvad kolmel erineval temperatuuril. DNA eksisteerib kaheahelalises vormis vesiniksidemete kaudu komplementaarsete aluste vahel. Enne implikatsiooni tuleks kaheahelaline DNA üksteisest eraldada. Seda tehakse kõrge temperatuuri andmisega. Kõrgel temperatuuril denatureerub kaheahelaline DNA üksikuteks ahelateks. Siis peaksid praimerid jõudma lähemale konkreetse fragmendi või DNA geeni külgnevatele otsadele. Praimer on lühike üheahelaline DNA tükk, mis täiendab sihtjärjestust. Esi- ja vastupidised praimerid lõõmutatakse lõõmutamistemperatuuril denatureeritud proovi DNA külgnevates otstes paiknevate komplementaarsete alustega. Praimerid peaksid olema kuumuskindlad. Kui praimerid lõõmutavad proovi DNA-ga, alustab taq-polümeraasi ensüüm uute ahelate sünteesi, lisades sihtmärk-DNA-le komplementaarseid nukleotiide. Taq polümeraas on soojusstabiilne ensüüm, mis on eraldatud termofiilsest bakterist nimega Thermus aquaticus. PCR-puhver hoiab Taq polümeraasi toimimiseks optimaalseid tingimusi. Neid kolme PCR reaktsiooni etappi korratakse vajaliku koguse PCR produkti saamiseks. Pärast iga PCR reaktsiooni kahekordistatakse DNA koopia arv. Seega võib PCR-is jälgida eksponentsiaalset amplifikatsiooni. PCR-tooteid saab jälgida geelelektroforeesi abil ja neid saab edasisteks uuringuteks puhastada.

Joonis 01: PCR-reaktsiooni peamised etapid

PCR on väärtuslik vahend meditsiinilistes ja bioloogilistes uuringutes. PCR omab kriminalistikas erilist väärtust, kuna see võib võimendada kurjategijate pisikestest proovidest pärinevat DNA-d ja teha kohtuekspertiisi DNA-profiile. PCR-i kasutatakse laialdaselt paljudes molekulaarbioloogia valdkondades, sealhulgas genotüpiseerimine, geenide kloonimine, mutatsioonide tuvastamine, DNA järjestamine, DNA mikrokiibid ja isadustestid jne..

Joonis 02: polümeraasi ahelreaktsioon

Mis on DNA järjestamine?

DNA järjestamine on nukleotiidide - adeniini, guaniini, tsütosiini ja tümiini - täpse järjestuse määramine antud DNA fragmendis. Geneetiline teave salvestatakse DNA järjestustesse, kasutades nukleotiidide õiget järjestust. Seega on nukleotiidide täpse järjekorra leidmine DNA fragmendis väga oluline teada geenide struktuuri ja funktsiooni kohta.

DNA sekveneerimise protokoll hõlmab erinevaid protsesse. Esimene samm on huvitatud DNA või organismi genoomse DNA eraldamine. PCR-i (nagu ülalpool kirjeldatud) kasutades tuleks DNA soovitud piirkonda võimendada. Amplifitseeritud PCR-i produkt tuleb eraldada geelelektroforeesiga ja puhastada. Amplifitseeritud fragmente kasutatakse järjestamise mallidena. Sekveneerimist saab teha kas pärast Sangeri sekveneerimist või suure läbilaskevõimega sekveneerimise meetodit. Sangeri sekveneerimine nõuab saadud DNA fragmentide kapillaarelektroforeesi. Nukleotiidide õige järjekorra saab määrata autoradiograafide käsitsi lugemise teel või automatiseeritud DNA järjestuste abil.

Geenijärjestus aitas kaasa inimese genoomi projektile ja hõlbustas inimese genoomi kaardistamist 2003. aastal. Kriminalistikas võimaldas DNA sekveneerimine identifitseerida isikud, kellel on unikaalsed DNA järjestused ja kurjategijad. Meditsiinis saab DNA järjestamist kasutada geneetiliste ja muude haiguste eest vastutavate geenide tuvastamiseks, defektigeenide leidmiseks ja õigete geenidega asendamiseks. Põllumajanduses kasutatakse majanduslikult soovitud omadustega transgeensete põllukultuuride saamiseks mõnede mikroorganismide DNA järjestamise teavet.

Joonis 03: DNA järjestamine

Mis vahe on PCR ja DNA järjestamine??

PCR vs DNA järjestamine
PCR-protsess loob huvitatud DNA fragmendi tuhandeid kuni miljoneid koopiaid.	DNA järjestamine on protsess, millega määratakse kindlaks nukleotiidide täpne järjestus antud DNA fragmendis.
Tulemus
PCR loob konkreetse DNA fragmendi tuhandeid kuni miljoneid koopiaid	Selle tulemuseks on aluste õige järjekord konkreetses DNA fragmendis.
DdNTP-de kaasamine
PCR ei vaja ddNTP-sid. See kasutab dNTP-sid.	DNA järjestamine nõuab ahela moodustumise lõpetamiseks ddNTP-sid.

Kokkuvõte - PCR vs DNA järjestamine

PCR ja DNA järjestamine on molekulaarbioloogia paljudes valdkondades väga olulised vahendid. DNA fragmentide amplifikatsioon viiakse läbi PCR meetodil, samal ajal kui DNA fragmendi nukleotiidide õige järjekord määratakse DNA sekveneerimisega. See on erinevus PCR ja DNA järjestamise vahel.

Viide:
1. “Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR).” Riiklik biotehnoloogiaalane teabekeskus. USA Riiklik Meditsiiniraamatukogu, n.d. Võrk. 21. veebruar 2017.
2. Shendure, Jay ja Hanlee Ji. "Järgmise põlvkonna DNA järjestamine." Loodusuudised. Looduskirjastusgrupp, 9. oktoober 2008. Veeb. 21. veebruar 2017

Pilt viisakalt:
1. Tinojasontrani „PCR-sammud” - Commons Wikimedia kaudu oma töö (avalik omand)
2. Enzoklop - polümeraasi ahelreaktsioon - Enda töö (CC BY-SA 3.0) Commonsi Wikimedia kaudu
3. „DNA järjestus” - autor Sjef - Commons Wikimedia kaudu oma töö (avalik omand)