Erinevus RT PCR ja QPCR vahel

Peamine erinevus - RT PCR vs QPCR
 

Polümeraasi ahelreaktsioon on tehnika, mida kasutatakse DNA konkreetse piirkonna amplifitseerimiseks in vitro. Selle meetodi leiutas Kary Mullis 1983. aastal ja seetõttu on teadlased võimelised teadusuuringute jaoks tegema tuhandeid kuni miljoneid koopiaid konkreetsetest DNA fragmentidest. Praegu on see kliinilistes ja teaduslaborites muutunud väga levinud ja rutiinselt kasutatavaks tehnikaks väga erinevates rakendustes. Traditsioonilises PCR-tehnikas on variatsioone, nagu RT PCR, pesastatud PCR, multipleksne PCR, Q PCR, RT - QPCR jne. RT PCR ja Q PCR on PCR kaks olulist variatsiooni. Peamine erinevus RT PCR ja Q PCR vahel on see RT PCR kasutatakse geeni ekspressiooni tuvastamiseks DNA loomise kaudutäiendav DNA (cDNA) koopiad RNA-st samas Q-PCR-i kasutatakse PCR-saaduste kvantitatiivseks mõõtmiseks reaalajas, kasutades fluorestsentsvärve.

SISU
1. Ülevaade ja peamised erinevused
2. Mis on RT PCR
3. Mis on QPCR
4. Kõrvuti võrdlus - RT PCR vs QPCR
5. Kokkuvõte

Mis on RT PCR?

Pöördtranskriptsiooni polümeraasi ahelreaktsioon (RT PCR) on PCR variant, mida kasutatakse RNA ekspressiooni tuvastamiseks. See on väga oluline meetod mRNA ekspressiooni tuvastamiseks kudedes. RT PCR kasutatakse juhul, kui proovi lähtematerjal on RNA. RT PCR-is muundatakse matriitsi mRNA kõigepealt komplementaarseks DNA-ks. Seda etappi katalüüsib ensüümi pöördtranskriptaas ja seda protsessi nimetatakse pöördtranskriptsiooniks. Teiseks kasutatakse äsja sünteesitud cDNA amplifikatsiooniks traditsioonilist PCR-i.

RT PCR on väga tundlik tehnika, mis nõuab suhteliselt väikest kogust RNA proovi. RT PCR-i kasutatakse tavaliselt RNA liikide, eriti RNA viiruste, näiteks inimese immuunpuudulikkuse viiruse ja C-hepatiidi viiruse diagnoosimisel ja kvantifitseerimisel.

Joonis 01: RT PCR tehnika

Mis on QPCR??

Kvantitatiivne PCR (QPCR) on PCR variant, mida kasutatakse PCR produktide kvantitatiivseks mõõtmiseks. Seda nimetatakse ka reaalajas polümeraasi ahelreaktsiooniks, kuna see mõõdab reaalajas võimendamist reaalajas PCR-masina abil. See on sobiv meetod proovis oleva sihtjärjestuse või geeni koguse määramiseks. QPCR-i huvitav omadus on see, et see ühendab ühe sammuna nii võimenduse kui ka tegeliku kvantifitseerimise. Seetõttu saab geelelektroforeesi vajaduse tuvastamisel QPCR-tehnikaga kõrvaldada. QPCR kasutab fluorestsentsvärve PCR-saaduste märgistamiseks PCR-reaktsioonide ajal, mis viivad lõpuks otsese kvantifitseerimiseni. Kui PCR-tooted kuhjuvad, kogunevad ka fluorestsentssignaalid ja seda mõõdetakse reaalajas masinaga. QPCR-i saab kombineerida RT PCR-ga. Seda tuntakse kui RT-QPCR või QRT-PCR ning seda peetakse kõige võimsamaks, tundlikumaks ja kvantitatiivsemaks meetodiks RNA taseme tuvastamiseks rakkudes või kudedes.

SYBR Green ja Taqman on kaks meetodit, mida kasutatakse reaalajas PCR amplifikatsiooni tuvastamiseks või jälgimiseks. SYBR Greeni meetodil kasutatakse fluorestsentsvärvi, mida nimetatakse SYBR greeniks, ja see tuvastab amplifikatsiooni värvaine sidumisega, moodustades kaheahelalise DNA. Taqman viiakse läbi kahe märgisega sondide abil ja tuvastab amplifikatsiooni sondi lagundamise teel Taq polümeraasi abil ja fluorofoori vabanemisega, nagu on näidatud joonisel 02. Mõlemad meetodid jälgivad amplifikatsiooniprotsessi kulgu ja teatavad toote koguse reaalajas..

Reaalajas PCR-l on lai valik rakendusi, näiteks geeniekspressiooni kvantifitseerimine, mikroRNA ja mittekodeeriva RNA analüüs, SNP genotüüpimine, koopiate arvu variantide tuvastamine, haruldaste mutatsioonide tuvastamine, geneetiliselt muundatud organismide tuvastamine, nakkusetekitajate tuvastamine jne..

Joonis 02: kvantitatiivne PCR-meetod

Mis vahe on RT PCR ja QPCR vahel?

RT PCR vs QPCR
RT PCR on tehnika, mida kasutatakse geeniekspressiooni tuvastamiseks amplifikatsiooni abil.	QPCR on meetod, mis võimendab DNA-d ja kvantifitseerib PCR-produktid reaalajas.
Pöördtranskriptaasi ensüümi kaasamine
RT PCR jaoks kasutatakse ensüümi pöördtranskriptaasi.	Ensüümi pöördtranskriptaasi QPCR jaoks ei kasutata.
Fluorestsentsmärgisega molekulide kasutamine
Fluorestsentsmärgistatud värvaineid ega sondid ei kasutata RT PCR jaoks.	QPCR jaoks kasutatakse fluorestsentsmärgistatud värvaineid või sondid.
PCR produkti kvantitatiivne määramine
RT PCR ei määra PCR produkti kvantitatiivselt, välja arvatud juhul, kui see on ühendatud QPCR-iga.	QPCR mõõdab PCR produkti kvantitatiivselt.
Algmaterjal
Lähteaineks on mRNA.	Lähtematerjal on DNA.
CDNA süntees
RT PCR-i käigus toodetakse täiendav DNA.	QPCR ajal ei toodeta täiendavat DNA-d.

Kokkuvõte - RT PCR vs QPCR

RT PCR ja QPCR on traditsioonilise PCR kaks versiooni. MRNA proovide jaoks teostatakse RT PCR meetod ja seda juhib pöördtranskriptsioon ja cDNA tootmine. QPCR-i kasutatakse PCR-saaduste kvantifitseerimiseks reaalajas PCR-termiliste tsüklite ajal, kasutades fluorestsentsvärve või märgistatud sondid. QPCR-is tähistatakse PCR-produkti kogust proovi poolt väljastatud fluorestsentssignaalidega. RT PCR-i kasutatakse rahvapäraselt võimendusprotsessina, QPCR-i kasutatakse tavaliselt kvantitatiivse protsessina. See on erinevus RT PCR ja QPCR vahel.

Viited:
1. Deepak, SA, KR Kottapalli, R. Rakwal, G. Oros, KS Rangappa, H. Iwahashi, Y. Masuo ja GK Agrawal. "Reaalajas PCR: revolutsiooniline geenide tuvastamine ja ekspressioonianalüüs." Praegune genoomika. Bentham Science Publishers Ltd., juuni 2007. Veeb. 03. aprill 2017
2. Zeka, Fjoralba, Katrien Vanderheyden, Els De Smet, Claude A. Cuvelier, Pieter Mestdagh ja Jo Vandesompele. "FFPE proovide sirgjooneline ja tundlik RT-qPCR-põhine geeniekspressiooni analüüs." Loodusuudised. Looduskirjastusgrupp, 22. veebruar 2016. Veeb. 03. aprill 2017
3. Overbergh, L., A. Giulietti, D. Valckx, B. Decallonne, R. Bouillon ja C. Mathieu. "Reaalajas pöördtranskriptaasi PCR kasutamine tsütokiini geeni ekspressiooni kvantifitseerimiseks." Biomolekulaarsete tehnikate ajakiri: JBT. Biomolekulaarsete ressursirajatiste ühendus, märts 2003. Veeb. 03. aprill 2017

Pilt viisakalt:
1. Kasutaja „Taqman”: Braindamaged - Originaalse üleslaadija (Public Domain) enda töö Commonsi Wikimedia kaudu
2. “Pöördtranskriptsiooni polümeraasi ahelreaktsioon” - autor Jpark623 - Oma töö (CC BY-SA 3.0) Commonsi Wikimedia kaudu